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組蛋白提取

發布者:艾美捷科技    發布時間:2021-06-08     
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組蛋白有四種類型:H2A、H2B、H3、H4,組蛋白是染色體基本結構蛋白,因富含堿性氨基酸 Arg 和 Lys 而呈堿性,可與酸性的 DNA 緊密結合。因為組蛋白是偏堿性的,因此我們可以使用酸法來提取。


實驗操作步驟:


1、將 3-5×105 個細胞種到 6 孔板中,接著進行自己需要的實驗處理,處理結束后開始收蛋白,先用 1×PBS 將細胞洗兩次,每次吸盡上清。


2、每孔加入 200ul NETN 裂解液,冰上裂解 15min


High salt NETN buffer


母液

配制 100ML


20mM Tris,PH=8.0

1M

2ml


500mM NACL

5M

10ml


0.5% NP-40

20%

2.5ml


1mM EDTA

0.5M

200ul


H2O


85.3ML


臨用前加蛋白酶抑制劑





3、用細胞刮刮細胞,將細胞收集于 1.5mlEP 管中,1500g,4℃,離心 10min


4、離心結束后可以在管底看到一小團接近透明的沉淀,小心吸盡上清,用 1ML NETN buffer 洗沉淀一次或兩次,1500g,4℃,離心 10min


5、吸盡上清,小心吸,沉淀容易被吸走,加入 0.2M HCL 100ul (濃鹽酸的濃度為 12M)冰水裂解 30min,(30min 后沉淀變成一個白色的小團塊)


6、12000RPM,4℃,15min 離心,此時組蛋白已經溶解在上清中,將上清轉移到新的 EP 管中,加入 20ul 的 1M Tris ph=8.0 中和酸性(5 倍體積的 HCL 加 1 倍體積的 1M Tris PH=8.0, 如 100ul 的上清中,可加入 20ul 的 1M Tris。


若中和不充分,則在下一步加入 SDS 的時候溶液會呈現黃色,可適量補加 1M Tris PH=8.0,只到溶液恢復藍色)。


7、可用考馬斯法測蛋白濃度


8、用 SDS 煮蛋白,100℃,10min.。接下來可進行 Western blot 實驗。


9、跑膠時,上樣量為 5ug 時比較適宜??梢愿鶕约旱木唧w實驗進行調整。


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