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重組蛋白質的表達、純化、復性和定量

發布者:艾美捷科技    發布時間:2021-06-08     
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按操作手冊進行,具體步驟如下。


一、重組蛋白質的誘導表達


1.挑取轉化有質粒的單菌落,接種于 3ml 選擇性 LB 液體培養基中,37 oC,250rpm/min 振搖培養過夜。


2. 次日將培養過夜的菌液 500 μl 再接種于 10 ml(1:::20)選擇性 LB 液體培養基中,37 oC,250 rpm/min 振搖培養至光密度(OD600=0.6)時,取 1 ml 樣本作為誘導前標本,10000g 離心 1 min 收集菌體沉淀,-20 oC 凍存備用。


3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌液中,使 IPTG 終濃度為 1 mM,37 oC,250 rpm/min振搖培養 4~5 小時。取 1 ml 樣本作為誘導后標本,同上法收集菌體沉淀,-20 oC 凍存備用。


4. 將誘導前后菌體沉淀用 20 ~ 40 μl PBS(pH= 8.0)重懸,加入等體積的 2×SDS上樣緩沖液,煮沸加熱 5 min,SDS 聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離 ,考馬斯亮藍染色 3 小時后,脫色觀察結果。


5. 選取誘導成功的細菌克隆,擴大誘導規模,收集菌體沉淀,于-20 oC 保 存 ,準備做下一步分析及純化。


二、重組蛋白質的分離純化


重組蛋白質的可溶性鑒定

1.將按上法誘導培養后收集的菌體重懸于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中,然后在-80 oC 低溫冰箱中放置 10 min。


2. 冰中解凍。


3. 在冰浴上用超聲破碎儀破菌 6 次,每次 10 sec,間歇 10 sec,電壓 200-300 V。


4. 10000g,4oC,離心 20 min,取上清(為溶液 A), -20 oC 保存;另將沉淀用同樣裂解液 1 溶解(為溶液 B),同樣-20 oC 保存,供后繼分析使用。


5. 將上述 A、B 溶液和誘導前后的細菌進行 SDS-PAGE 電泳,考馬斯亮藍染色,比較分析重組蛋白質的溶解性。如果誘導表達的蛋白質位于 A 溶液中,則為可溶性蛋白;如果是在 B 溶液中,則為非可溶蛋白。


重組蛋白質為非可溶性蛋白(變性條件下)的分離純化

1.將菌體沉淀溶于適量裂解液 2(Lysis buffer under denaturing conditions )中,室溫下攪拌和吹打沉淀,避免泡沫生成。


2. 10000g,4 oC,離心 30 min,收集上清液。


3. 將 Ni-NTA Agarose 充填柱子,并連接于 Pharmarcia 低壓液相層析系統,用 5倍柱體積的裂解液 2 平衡 Ni-NTA Agarose,調節 A280 值至零線。


4.將適量上清液上樣到 Ni-NTA Agarose 柱子中,并用 lysis buffer 沖洗至 A280值低于 0.01。


5. 分別用 5~10 倍柱體積的清洗液 1 和清洗液 2(Wash buffer 1 and 2)清洗柱子,直至 A280 值低于 0.01。


6. 用洗脫液(Elution buffer)洗脫重組蛋白質,在 A280 值監測下,收集出現峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。


三、重組蛋白質的復性、凍干和定量

純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析,最終用 0.01×PBS 透析,透析后的蛋白質溶液經凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標準,采用 BIO-RAD 公司蛋白質定量試劑(protein assay)比色測定蛋白質的含量。




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