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Jackson SRM應用熒光標記二抗

發布者:艾美捷科技    發布時間:2020-12-31     
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       艾美捷科技作為Jackson中國區域總代理,將為您提供Jackson的特色優質產品主要包括各種純化的二抗、標記的二抗(AMCA、 Cy2、FITC、Cy3、TRITC、RRX、TR、Cy5、長臂生物素、辣根酶和堿磷酶標記)、膠體金試劑等。今天主要為您介紹SRM應用熒光標記二抗,看下文介紹:

      如今,科學家們已經研發了多種超分辨率技術,遠遠超出了衍射極限,能夠觀察到分子尺度的細節。SRM技術可以將細胞結構解析為亞細胞水平,從而獲取有關細胞組分的3D結構的信息,并可以觀察到單分子共定位。下面我們來簡要概述了時下幾種最流行的SRM技術的原理:

       1.受激發射耗竭(STED)顯微鏡

      STED對于有經驗的熒光顯微鏡使用者來說相對簡單,該方法和普通共聚焦顯微鏡(Confocal)的原理相同。普通Confocal使用單光源,而STED使用雙光源。其中一個光源發射能激發熒光團&mdash;&mdash;熒光標簽(研究者們以此來定位和觀察蛋白)的光,另一個光源發出不同波長的光,用于抑制熒光。這束光是環形的,并且與第一束光有所重疊,因此只有環形中間區域的分子會繼續發出熒光。

獲得STED超分辨率圖片并沒有那么復雜,用戶需要仔細調整參數,才能得到漂亮的結果,否則所得圖片和普通confocal沒有差別。


STED.jpg


      使用傳統和RESCue受激發射減損顯微鏡(STED)得到的細胞核膜上核孔復合體的圖片。

       STED的原理:

      顯微鏡透鏡對光的衍射會導致來自單個點的光出現在較大的區域,這稱為點擴散函數(PSF)(見圖1),由于PSF的存在,使得常規顯微鏡無法達到超分辨。


PSF.png

       圖1:在普通光學顯微鏡中,成像是通過將來自點光源的光線會聚到像平面上的單個點來實現的。超出光衍射的限制,防止了射線的精確會聚,從而導致物體的圖像模糊。顯微鏡的分辨率取決于點擴散函數(PSF)的大小,或對象在某個點的三維強度分布。在STED中,應用環形炸彈耗盡型激光器,其零點與激發激光焦點的最大值重疊。STED激光器引起熒光的“飽和耗盡”,從而“抑制了來自零點附近區域的熒光,導致有效PSF的尺寸減小”。

      而受激發射耗竭(STED)顯微鏡通過限制樣品的熒光區域(PSF)產生超分辨率圖像。STED顯微鏡使用兩個重疊的激光,第一個按照常規顯微鏡激發熒光團(圖2A)。第二個激光器稱為耗盡激光器(STED激光器),它激發“甜甜圈”形狀的激光,其中心的零強度點非常?。?30 nm)(未激發)。除了在甜甜圈的中心處之外,第二激光起到了“關閉”第一激光所產生的外圈熒光,從而將樣本激發的熒光分子范圍縮小到中心圓點處,這有效地降低了PSF,以產生非常小的單分子熒光聚焦區域,從而獲得高分辨率圖像(圖2D)。


PSF-1.jpg

       圖2

      1.單個小于250 nm的蛋白質無法通過標準共聚焦成像解析,從而導致圖像模糊

      2.STED耗盡激光器產生了淬滅外圍熒光的“甜甜圈”

      3.飽和耗盡在功能上降低了激勵PSF

      4.隨之可以解析單個蛋白質

       適用于STED的熒光團偶聯抗體:

      為了獲得超分辨率,染料必須具有STED激光波長的高發射截面,并有效地實現高飽和度。這種強烈的照明確保了所有被STED激光“關閉”的分子都受受激發射的支配。合適的染料應具有低的光漂白性,具有高的量子產率和對比度,并在目標附近具有足夠的標記密度。

      Jackson提供熒光染料標記的二抗,下列染料標記的二抗已被驗證在STED中成功使用:


染料貨號
AlexaFluor&reg;488115-545-003
FITC715-095-150
AlexaFluor&reg;594715-585-151
AlexaFluor&reg;647 

     

        2. 隨機光學重建顯微鏡(STORM)

      最有名的“基于探針”的技術是Betzig等人研發的光激活定位顯微技術(photoactivated localization microscopy, PALM)和哈佛大學莊小威實驗室發明的隨機光學重建顯微技術(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。最初所有的熒光標簽都是暗的。然后使用激光脈沖來激活一小部分熒光標簽,隨后使用另一束光來關閉這些熒光標簽。不斷重復這個過程,生成一系列部分熒光圖,最后重建成整個視野的熒光圖。,以產生分辨率優于常規方法收集的圖像。


STORM.jpg


      使用超分辨率隨機光學重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM),科學家首次觀察到了神經元軸突的細胞骨架。

      Jackson提供適用于dSTORM應用的標記二抗,簡而言之,較低強度的激發光激發樣品,隨機激活少量染料分子。單個發熒光的染料分子足夠分散,因此可以計算其點擴散函數的中心,從而推斷出染料的確切位置。然后使用第二激光關閉所有分子,并重復該過程。然后,通過重疊每種染料的所有映射點擴展函數,以數學方式生成高分辨率圖像。

       用于單分子定位實驗的熒光團偶聯抗體

 用于單分子定位的最佳染料通常非常亮,并產生足夠的光子以可靠地產生緊密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多種廣譜范圍內的可靠染料,例如AlexaFluor&reg;488,AlexaFluor&reg;647和Cy&trade;5,可用于這些類型的實驗。

       建議用于超分辨率顯微鏡的熒光染料偶聯物:


STED激發波長(nm)發射波長(nm)
Alexa Fluor&reg; 488493519
熒光素 / FITC492520
Alexa Fluor&reg; 594591614
Alexa Fluor&reg; 647651667

 

STORM激發波長(nm)發射波長(nm)
Alexa Fluor&reg; 488493519
Alexa Fluor&reg; 647651667
Cy&trade;5650670

      每種SRM技術都有各自的探針選擇要求,Jackson ImmunoResearch提供多種已知在SRM應用中表現良好的熒光標記二抗。應該注意的是,SRM領域變化迅速,因此,建議從專業技術文獻中尋求信息,以幫助選擇合適的熒光團。

      更多相關Jackson ImmmoResecarch品牌的SRM應用熒光標記二抗產品詳情,歡迎點擊查看:超分辨率顯微鏡分析,熒光抗體該怎么選?

      作為Jackson ImmmoResecarch在中國的區域代理,艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供最全面的ackson ImmmoResecarch品牌的SRM應用熒光標記二抗產品以及訂制服務,歡迎隨時聯系我們。


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