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AAT Bioquest——Caspases酶系列1:底物及抑制劑

發布者:艾美捷科技    發布時間:2021-06-28     
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什么是胱天蛋白酶?

胱天蛋白酶(Caspases)是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,它們是為細胞凋亡的主要介質。多種受體,例如TNF-α 受體,FasL受體,TLR和死亡受體,以及Bcl-2和凋亡抑制劑(IAP)蛋白家族參與并調節該caspase依賴性凋亡途徑。一旦Caspase受到上游信號(外部或內在)刺激被激活,即會參與執行下游蛋白底物的水解作用,并觸發一系列事件,導致細胞分解,死亡,吞噬作用和細胞碎片的清除。

 

人Caspases酶

人的Caspases家族基于序列相似性和生物學功能等共性主要可分為三大類:第一類由具有長胱天蛋白酶募集結構域的“炎癥”胱天蛋白酶組成,他們對P4位上的較大的芳香族或疏水性殘基具有親和力。第二類由具有短的前體結構域的“細胞凋亡效應”胱天蛋白酶組成,而第三類由具有長的前提結構域的Pap位置具有亮氨酸或纈氨酸底物親和力的“凋亡引發劑”胱天蛋白酶組成(表1)。

 

表1.人胱天蛋白酶的功能分類

細胞死亡途徑半胱天冬酶類型酵素物種
細胞凋亡啟動器Caspases 2人與鼠
細胞凋亡啟動器Caspases 8人與鼠
細胞凋亡啟動器Caspases 9人與鼠
細胞凋亡啟動器Caspases 10人的
細胞凋亡效應器Caspases 3人與鼠
細胞凋亡效應器Caspases 6人與鼠
細胞凋亡效應器Caspases 6人與鼠
細胞焦亡炎性的Caspases 1人與鼠
細胞焦亡炎性的Caspases 4人的
細胞焦亡炎性的Caspases 5人的

 

啟動器Caspase和效應器Caspase

根據其在凋亡胱天蛋白酶途徑中的作用,胱天蛋白酶可分為兩類:啟動器和效應器Caspase酶。啟動器和效應器Caspas酶都具有由小亞基和大亞基組成的催化位點,Caspase酶的識別位

 


 

凋亡啟動器Caspase酶,例如caspase-2,-8,-9和-10可以啟動caspase激活級聯反應。Caspase-8對于形成死亡誘導信號復合物(DISC)是必不可少的,并且在激活后,Caspase-8激活下游效應子Caspase(例如Caspase 3)并介導線粒體中細胞色素c的釋放。Caspase-8已被證明對IETD肽序列具有相對較高的底物選擇性。凋亡效應胱天蛋白酶例如Caspase-3,-6和-7雖然不負責啟動級聯途徑,但是當被激活時,它們在級聯的中間和后續步驟中起著不可或缺的作用。Caspase-3(CPP32 / apopain)是關鍵效應器,因為它放大了來自啟動器Caspase的信號,使用對Caspase-3有選擇性的DEVD肽序列對活化的Caspase-3進行檢測,可以檢測Caspase-3的活性。

 

 Caspase酶底物和抑制劑

Caspase底物和抑制劑由兩個關鍵成分組成:Caspase識別序列和信號產生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase識別序列不同,一般由三個或四個氨基酸組成(表2)。Caspase酶識別序列的N端通常有乙?;ˋc)碳苯甲氧基(Z)基團修飾,以增強膜的通透性。對應的Caspase識別特定的肽序列為其酶促反應切割位點,釋放產生信號或抑制信號的基序。Caspase的顯色和熒光底物均以相似的方式起作用,其中底物的信號或顏色強度與蛋白水解活性成正比。

 

表2. Caspase底物及其序列

多肽氨基酸序列對應的Caspase的種類
IETDIle-Glu-Thr-AspCaspase 8,顆粒酶B
DEVDAsp-Glu-Val-AspCaspase 3、6、7、8或10
LEHDLeu-Glu-His-AspCaspase 9
VADVal-Ala-AspCaspase 1、2、3、6、8、9或10


Caspase的顯色底物

Caspase的顯色底物是有Caspase識別序列及生色基團組成,常見的生色團有pNA(對硝基苯胺或4-硝基苯胺),可使用酶標儀或分光光度計在405 nm處進行光密度檢測。

 

表3. Caspase的顯色底物

底物Caspase吸收(nm)顏色規格貨號
Ac-DEVD-pNA * CAS 189950-66-1 *半胱天冬酶3405 nm黃色5 mg13405
Z-DEVD-pNA半胱天冬酶3405 nm黃色5 mg13422
Z-IETD-pNA * CAS 219138-21-3 *半胱天冬酶8,顆粒酶B405 nm黃色5 mg13413

 

Caspase的熒光底物

Caspase的熒光底物的結構包含與半胱天冬酶識別相關的熒光團,例如7-氨基-4-甲基香豆素(AMC),7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC), Rhodamine 110(R110)或ProRed?620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物(例如AMC和AFC)更敏感,但由于兩步裂解過程,其動態范圍更窄。 建議將R110標記的Caspase底物用于終點法測定,而將AMC和AFC標記的 Caspase底物用于動力學測定。

 

Caspase的熒光底物.jpg

圖.從左到右,分別是AMC(7-氨基-4-甲基香豆素),AFC(7-氨基-4-三氟甲基香豆素),Rhodamine 110(R110)和ProRed?620的激發和發射光譜。

 

表4.熒光半胱天冬酶底物。

底物名稱對應的CaspaseEx(nm)Em(nm)ε?Φ?規格貨號
Ac-DEVD-AFC * CAS 201608-14-2 *半胱天冬酶3、7376482170000.535mg13401
Ac-DEVD-AMC * CAS 169332-61-0 *半胱天冬酶3、734144119000N / D5mg13402
Z-DEVD-AFC半胱天冬酶3、7376482170000.535mg13420
Z-DEVD-AMC * CAS 1135416-11-3 *半胱天冬酶3、734144119000N / D5mg13421
Z-DEVD-ProRed?620半胱天冬酶3、7532619N / DN / D1mg13433
(Z-DEVD)2 -R110 * CAS 223538-61-2 *半胱天冬酶3、750052280000N / D1mg13430
Z-DEVD-ProRed?620半胱天冬酶3、7532619N / DN / D1mg13433
Ac-IETD-AFC * CAS 211990-57-7 *半胱天冬酶8,顆粒酶B376482170000.535mg13410
交流電-IETD-AMC半胱天冬酶8,顆粒酶B34144119000N / D5mg13411
Z-IETD-AFC * CAS 219138-02-0 *半胱天冬酶8,顆粒酶B376482170000.535mg13425

 

注意

  1. ε=在其最大吸收波長處的摩爾消光系數(單位= cm -1-1)。

  2. Φ=水性緩沖液(pH 7.2)中的熒光量子產率。

 

Caspase抑制劑

Caspase抑制劑能與Caspase的活性位點結合并形成可逆或不可逆的連接,通常,Caspase抑制劑的結構由Caspase識別序列,諸如醛(-CHO)或氟甲基酮(-FMK)的官能團組成。具有醛官能團的胱天蛋白酶抑制劑是可逆的,而具有FMK的抑制劑是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制劑都具有較小的細胞毒性作用,因此,它們是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

 

表5.可逆和不可逆的Caspase酶抑制劑

抑制劑Caspase的種類是否可逆Ex(nm)Em(nm)規格貨號
Ac-DEVD-CHO * CAS 169332-60-9 *半胱天冬酶3、7可逆的----1mg13403
Ac-IETD-CHO * CAS 191338-86-0 *半胱天冬酶8可逆的----5mg13412
mFluor?450-VAD-FMK半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10不可逆的40644525 tests13475
mFluor?510-VAD-FMK半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10不可逆的41250525 tests13476
FITC-C6-DEVD-FMK半胱天冬酶3、7不可逆的4915161mg13406
FITC-C6-DEVD-FMK半胱天冬酶3、7不可逆的491516100ug13408
FITC-C6-LEHD-FMK半胱天冬酶9不可逆的4915161mg13407
FITC-C6-LEHD-FMK半胱天冬酶9不可逆的491516100ug13409
FAM-VAD-FMK半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10不可逆的49351725 tests13470
SRB-VAD-FMK [磺胺丁胺B-VAD-FMK]半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10不可逆的55957725 tests13472

 

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