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BioVendor miRNA定量檢測試劑盒(PCR法)

發布者:艾美捷科技    發布時間:2021-07-06     
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miRNA是許多人類病理學中有潛力的診斷和預后生物標志物,如何準確對miRNA進行定量呢?前期我們介紹了免疫法定量miRNA的試劑盒,今天介紹常規基于PCR法的miRNA定量的試劑盒——雙尾RT-qPCR。


傳統microRNA PCR檢測方法的痛點:用傳統的PCR法檢測microRNA的挑戰在于,兩個常規PCR引物的總長度幾乎是microRNA長度的兩倍,因此不適合于做miRNA的引物。以前的技術通過使用發夾引物延伸microRNA,添加poly A尾巴或通過連接添加片段來解決這個問題,但是這會降低檢測的靈敏度和特異性。此外,這些方法無法檢測在3'末端修飾的microRNA,因為它會干擾延伸過程。

 

市面上常見的miRNA定量檢測試劑盒原理

市面上常見的miRNA定量檢測試劑盒原理

 

BioVendor專利產品——雙尾RT-qPCR

我們專利的雙尾RT-qPCR技術,具有獨特的RT引物機制,與其他方法相比,可提供出色的靈敏度和特異性。雙尾RT-qPCR技術已被開發用于總的miRNA和piRNA的定量。

 

雙尾RT-qPCR原理:與使用單個結合探針不同,雙尾PCR使用兩個半探針,它們分別結合到不同的microRNA片段上,這些片段通過折疊的系鏈連接。雖然每個半探針本身都很短, 無法結合到microRNA上,但當兩個半探針互補時,它們會協同結合,這種結合的特異性是非常高的,因為在短半探針中錯配的影響非常大。然后可以使用兩個特定序列引物對形成的cDNA進行PCR擴增,用SYBR進行檢測。

 

雙尾RT-qPCR原理

 

雙尾RT-qPCR優勢:

  • 高靈敏度(最多少于10個分子)

  • 高特異性

  • 適合于多種樣本(血漿/血清,血液,組織等)中的miRNA檢測和定量

  • 通過折疊的系鏈連接的兩個半探針(結合不同的microRNA片段)

  • 動態范圍廣(高達9 log)

  • 在進行單重qPCR之前,可進行雙管多重RT-PCR

  • 提供定制化服務

 

1.高靈敏度及特異性:

  • 5?互補片段顯著提高分析的靈敏度:


 雙尾RT-qPCR優勢

  • 5? 互補片段顯著提高檢測的特異性:


 雙尾RT-qPCR優勢


5′-hemiprobe的特異性及靈敏度驗證:為了測試5′-hemiprobe對特異性的貢獻,我們比較了兩種雙尾RT引物區分Let-7 miRNA家族的兩個成員:Let-7a和Let-7f的能力,它們僅有位于miRNA序列中心的單個核苷酸的差異。RT 1引物的5'-hemiprobe設計成與let-7a的5'-末端的前十個核苷酸結合, 而RT 2引物的5'-hemiprobe結合在let-7a的8個核苷酸上,通過這種設計,區分let-7a和let-7f的核苷酸只是由RT 2引物的5′-hemiprobe檢測的,而不是由RT 1引物檢測的。RT 2引物的5′-hemiprobe也很短(8個核苷酸),因為我們認為探針序列較短時錯配的影響會更加明顯。其余的RT 1和RT 2引物序列以及所用的PCR引物是完全相同的。使用RT 2引物時,完全匹配和錯配的模板之間的ΔCq(ΔCq= 11.07)顯著大于使用RT 1引物(ΔCq = 4.66),不帶有5′-hemiprobe的不同堿基重疊的RT 2引物,而不是不帶有RT 1引物的RT 2引物。這證明了5'-半探針對系統特異性的重大貢獻。值得注意的是,兩種雙尾RT引物完全互補的let-7a microRNA的Cq值相等,表明即使5′-hemiprobe的長度有兩個堿基的不同,檢測靈敏度仍然相同。

 

2.適用樣本類型豐富:

5′-hemiprobe.png

新鮮組織,冷凍/福爾馬林固定組織的

血漿/ 血清/ 尿液/ 腦脊液/ 生物液體新鮮組織,冷凍/福爾馬林固定組織的

細胞,外泌體

細胞,外泌體

 

3.miRNA定量的試劑盒檢測流程簡便:

5′-hemiprobe-3.jpg

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